Analysis of gene expression pattern in renal cell carcinoma stem cells derived from primary and metastatic cancer site

Abstract

Rak nerkowokomórkowy [renal cell carcinoma, RCC], najczęstszy typ nowotworu nerki, może rozwijać się z różnych komórek budujących nefron. Śmiertelność pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym jest największa wśród nowotworów układu moczowo-płciowego,takich jak rak pęcherza moczowego, prostaty czy jąder. RCC jest odpowiedzialny za 3% wszystkich przypadków nowotworów odnotowywanych na całym świecie i jego występowanie w trakcie ostatnich 30 lat stale wzrasta. Rak nerkowokomórkowy jest heterogenny, tj. wyróżnia się wiele jego typów histologicznych, a każdy podtyp wykazuje wysoki stopień różnorodności przebiegu klinicznego. Rokowania dla tego nowotworu są niekorzystne, a z powodu późnego wykrywania choroby u 60% pacjentów rozwijają się przerzuty, co skutkuje wysoką śmiertelnością RCC. Przypuszcza się, że lekooporność/oporność na terapię, progresja, przerzutowanie i nawrót RCC warunkowane są przez macierzystopodobne komórki nowotworowe [SCLCC, stem cell-like cancer cells]. Charakteryzują się podobnymi właściwościami jak prawidłowe komórki macierzyste, takimi jak: zdolność do samoodnawiania własnej populacji i różnicowania czy tworzenia kolonii. Są także często oporne na działanie leków i posiadają specyficzne markery nowotworowe oraz mogą odtwarzać cały guz po przeszczepieniu. Mechanizm przekształcania prawidłowych komórek macierzystych w SCLCC wciąż nie został poznany. Dlatego dla opracowania skutecznych strategii terapeutycznych i prewencji raka nerkowokomórkowego ważne jest wyizolowanie i scharakteryzowanie jego SCLCC. Umożliwi to zidentyfikowanie markerów tej populacji i opracowanie nowych terapii celowanych z wykorzystaniem profilowania ekspresji genów tych komórek. W ostatnich latach opracowano kilka technik detekcji i określania liczebności komórek macierzystopodobnych raka nerkowokomórkowego. W niniejszej pracy do izolacji SCLCC zastosowano metodę opartą na obecności markerów powierzchniowych, wykorzystującą cytometrię przepływową. Celem tych badań było określenie wzoru ekspresji genów komórek macierzystopodobnych raka nerki pochodzących z guzów pierwotnych oraz przerzutowych. Opracowano model badawczy in vitro, aby określić zmiany ekspresji genów w SCLCC z wykorzystaniem metody mikromacierzy oraz innych narzędzi biologii molekularnej i bioinformatyki. W niniejszej pracy wybrano markery CD105 i CD133 do identyfikacji komórek macierzystopodobnych w liniach komórkowych RCC. CelePracyOpracowano model badawczy in vitro, aby określić zmiany ekspresji genów w SCLCC z wykorzystaniem metody mikromacierzy oraz innych narzędzi biologii molekularnej i bioinformatyki. W niniejszej pracy wybrano markery CD105 i CD133 do identyfikacji komórek macierzystopodobnych w liniach komórkowych RCC. Głównymi zadaniami pracy są: opracowanie komórkowego modelu in vitro komórek macierzystopodobnych, charakterystyka SCLCC wyizolowanych z pierwotnego i przerzutowego raka nerki, porównanie ekspresji genów SCLCC wyizolowanych z pierwotnego oraz przerzutowego RCC, analiza zmian w szlakach sygnałowych w SCLCC w oparciu o ekspresję genów. Metodą real-time PCR przeprowadzono analizę ekspresji genów związanych z macierzystością komórek, takich jak Oct-4, Nanogi Ncam. Z wykorzystaniem hodowli w półpłynnym agarze (soft agar colony formation assay) oceniono cechy macierzystości linii komórkowych raka nerki. Obecność markerów CD105 i CD133 na komórkach RCC potwierdzono metodą cytometrii przepływowej, którą wykorzystano także do sortowania subpopulacji komórek. Następnie komórki CD105+ z linii komórkowych raka pierwotnego i przerzutowego charakteryzowano pod kątem ekspresji markerów mezenchymalnych: CD24, CD146, CD90, CD73, CD44 i fosfatazy alkalicznej. Do oceny interakcji międzykomórkowych komórek CD105+ zastosowano hodowlę w wiszącej kropli. Zdolność do tworzenia zawiesinowych struktur trójwymiarowych przez komórki CD105+ posłużyła do potwierdzenia obecności niezróżnicowanych multipotencjalnych komórek progenitorowych w tej populacji. Wysortowane komórki CD105+ z linii komórkowych pierwotnego (Caki-2) oraz przerzutowego (ACHN) raka nerki wykorzystano do profilowania ekspresji genów metodą mikromacierzy z wykorzystaniem chipów Agilent human GE 4x44K v2. Geny o zmienionym poziomie ekspresji w komórkach CD105+ zostały zanalizowane metodą Ingenuity Pathway Assay (IPA), co umożliwiło skonstruowanie sieci genów i szlaków sygnałowych kluczowych dla komórek macierzystopodobnych raka nerki. Metodą barwienia immunocytochemicznego oceniono poziom ekspresji markerów powierzchniowych CD10 i CK7 w wykorzystywanych liniach komórkowych w celu określenia ich podtypów histologicznych, wykorzystywanych w klasyfikacji RCC. Obecność markerów CD10 lub CK7 na komórkach charakteryzuje, odpowiednio, raka jasnokomórkowego [ccRCC] lub brodawkowatego [pRCC] nerki. Następnie, za pomocą cytometrii przepływowej określono czy na badanych komórkach występują receptory uznawane za markery komórek macierzystych, m. in.:CD44, CD24, CD34, CD105 i CD133. Aby określić czy badane linie wykazują właściwości komórek macierzystopodobnych, zmierzono w wykorzystywanych liniach poziom ekspresji Oct-4, Nanogi Ncam metodą real-time PCR oraz zdolność do tworzenia kolonii metodą hodowli w półpłynnym agarze. W wyizolowanych SCLCC-CD105+ oceniono obecność markerów komórek mezenchymalnych: CD24, CD146, CD90, CD73,CD44 oraz hematopoetycznych: CD34, CD11b, CD19, CD45 i HLA-DR. Następnie przeprowadzono funkcjonalną charakterystykę komórek CD105+; zdolność do tworzenia kolonii, interakcje komórkowe w modelu wiszącej kropli oraz aktywność alkalicznej fosfatazy. Przeprowadzone analizy pozwoliły określić zachowanie komórek CD105+ w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Następnie wykonano analizę globalnej ekspresji genów metodą mikromacierzy w komórkach CD105+ -wyizolowanych z linii komórkowej pierwotnego i przerzutowego RCC oraz komórek zdrowej nerki. Wykazano, że w komórkach CD105+ pochodzących z przerzutowego RCC 5087 genów wykazywało zmienioną ekspresję względem komórek nerki. Dla 2324 genów była ona zwiększona, dla 2763 natomiast obniżona. Z kolei w komórkach CD105+ pochodzących z pierwotnego RCC odnotowano zmienioną, względem komórek zdrowych, ekspresję 2960 genów -dla 1346 była ona zwiększona, dla 1614 zmniejszona. Kolejnym krokiem było porównanie ekspresji genów komórek CD105+ pochodzących z pierwotnego RCC oraz przerzutowego RCC. 1411 genów o zmiennej ekspresji charakteryzujących komórki guza przerzutowego/pierwotnego poddano dokładniejszej analizie bioinformatycznej. Przeprowadzono analizę bazy Gene Ontology (GO) w celu określenia jakie funkcje pełnią zidentyfikowane geny.Programem Ingenuity Pathway Analysis (IPA) oraz w bazie KEGG przeprowadzono analizę genów zmiennie eksprymowanych w komórkach CD105+ określając zmienione ścieżki sygnałowe, sieci genów i kluczowe czynniki regulujące transkrypcję związane z RCC oraz innymi chorobami. Analiza wykazała zaburzenie w komórkach CD105+ szlaków sygnałowych TGF-β, Wnt/β-katenina, EMT, Rap1, PI3K-Akt oraz Hippo. Najbardziej istotnymi czynnikami regulującymi transkrypcję aktywnymi w tych komórkach są TGFB1, ERBB2 oraz TNF. Podsumowując, otrzymane wyniki sugerują, że komórki CD105+ raka nerkowokomórkowego wykazują właściwości macierzystopodobnych komórek nowotworowych. Mogą one tym samym stanowić nowy cel dla terapii RCC. Unikalny profil ekspresji genów w komórkach CD105+ może zostać wykorzystany jako wstępne dane dla dalszych badań/analiz funkcjonalnych i projektowania leków.