Analiza nosicielstwa z identyfikacją sero- i genogrup oraz określenie kompleksów klonalnych Neisseria meningitidis w środowisku wojskowym

Abstract

Inwazyjna choroba meningokokowa (IChM) jest jedną z najciężej przebiegających klinicznie chorób zakaźnych, pomimo możliwości wczesnego włączenia antybiotykoterapii i rozwoju intensywnej opieki medycznej nad pacjentem. Szerzenie zakażenia odbywa się najczęściej drogą kropelkową i przez kontakt z wydzielinami osób chorych oraz bezobjawowych nosicieli, którzy stanowią 5-10% populacji ogólnej. Ocenia się, że wyższe poziomy nosicielstwa Neisseria meningitidis występują w środowiskach zamkniętych, np.w wojsku. Badania przeprowadzone pod koniec XX wieku wśród żołnierzy służby zasadniczej wykazały poziom nosicielstwa meningokoków przekraczający 60%. Po zakończeniu w 2009 r. służby zasadniczej, środowisko wojskowe w Polsce jest reprezentowane przez żołnierzy zawodowych, których dane socjodemograficzne oraz charakter pracy różnią się od zamkniętego środowiska młodych rekrutów pełniących 24-godzinną służbę w systemie koszarowym. Polska należy do krajów o nieznanych poziomach nosicielstwa Neisseria meningitidis. Minister Obrony Narodowej na mocy rozporządzenia z 12.02.2014 r., wprowadził obowiązkowe szczepienia przeciw zakażeniom meningokokowym grup A,B,C,W135,Y dla wszystkich żołnierzy zawodowych w Wojsku Polskim. Rozprawa jest próbą oceny aktualnej sytuacji epidemiologicznej i charakterystyki mikrobiologicznej N. meningitidis w środowisku wojskowym, w kontekście wprowadzenia racjonalnej immuno-profilaktyki przeciwmeningokokowej. Celami pracy były: ocena poziomu nosicielstwa Neisseria meningitidis w środowisku żołnierzy zawodowych w Polsce, analiza sero-i genogrup oraz kompleksów klonalnych u wykrytych nosicieli N. meningitidis, określenie czynników ryzyka mogących mieć wpływ na występowanie zakażeń meningokokowych w środowisku wojskowym, ocena zasadności wprowadzenia obowiązkowych szczepień przeciw zakażeniom wywołanym przez N. meningitidis w Siłach Zbrojnych RP. Analizę nosicielstwa Neisseria meningitidis z identyfikacją sero-i genogrup oraz określeniem kompleksów klonalnych w środowisku wojskowym wykonano w oparciu o badania żołnierzy zawodowych pełniących służbę w 10. Brygadzie Kawalerii Pancernej w Świętoszowie. Materiał biologiczny (wymaz z jamy nosowo-gardłowej) został pobrany na terenie jednostki wojskowej od 1744 żołnierzy (861 osób –badanie jednokrotne w 2015 lub 2016 r., 883 osoby – badanie dwukrotne w latach 2015-2016) w I kwartale 2015 r. oraz w I kwartale 2016 r. Uzyskany materiał opracowano tuż po pobraniu wykonując posiew redukcyjny na stałym podłożu mikrobiologicznym Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej i na podłoże PoliVitex VCA3. Po przetransportowaniu posiewów do pracowni mikrobiologicznej Wojskowego Instytutu Medycznego, materiał biologiczny został oceniony makroskopowo i mikroskopowo. Szczepy o morfologii ziarenkowców Gram-ujemnych, wykazujących obecność katalazy i oksydazy cytochromowej, identyfikowano na podstawie cech biochemicznych wykorzystując kartę NH i aparat Vitek 2. Szczepy, które zidentyfikowano jako Neisseria meningitidis zostały zamrożone w temp. -20°C, a następnie przetransportowane do Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN) celem dalszej diagnostyki. Wszystkie izolaty poddano typowaniu serologicznemu używając zestawu surowic do aglutynacji szkiełkowej. Test do typowania serologicznego jest oparty na wykrywaniu otoczkowych antygenów Neisseria meningitidis poszczególnych serogrup przy użyciu surowicy monowalentnej. Zakres badań obejmował serogrupy A,B,C,E29,W135,X,Y,Z. Typowanie wykonano z kolonii wyizolowanych na podłożu Meuller Hinton po identyfikacji gatunku. Przynależność genogrup ustalano na podstawie reakcji PCR, używając mieszaniny reakcyjnej oraz wykorzystując specyficzne startery oligonukleotydowe. Analizę produktów przeprowadzono na żelu agarozowym. Określono genogrupy izolatów A,B,C,E29,W135,Y. Fragmenty siedmiu genów wyizolowanego DNA badanych szczepów poddano sekwencjonowaniu na podstawie strony http://pubmlst.org/neisseria/info/primshtmlers. Nosicielstwo Neisseria meningitidis w latach 2015-2016 stwierdzono przynajmniej jeden raz u 76 żołnierzy (8,6% grupy badanej). W 2015 r. wykryto 68 nosicieli (4,9% grupy badanej), natomiast w 2016 r. – 65 nosicieli (5,2% grupy badanej). Nosicielstwo pojawiło się w dwóch kolejnych latach u 31 żołnierzy. W 2015 r. dla 58 izolatów zidentyfikowano 6 genogrup: B (n=43, 63,2%), E29 (n=7, 10,3%), C (n=5, 7,4%), Y (n=2, 3,0%), A (n=1, 1,5%), W (n=1, 1,5%); dziewięć izolatów (NG, 13,2%) nie poddało się genogrupowaniu z zastosowanymi starterami. W 2016 r. dla 56 izolatów zidentyfikowano 5 genogrup: B (n=34, 52,3%), E29 (n=8, 12,3%), C (n=6,9,2%),Y (n=6, 9,2%), W (n=2, 3,1%); dziewięć izolatów (NG, 13,8%) nie poddało się genogrupowaniu z zastosowanymi starterami. Na podstawie wyników analizy MLST w badanej grupie izolatów zidentyfikowano 38 różnych typów sekwencyjnych. Najwięcej, po dwóch przedstawicieli miały ST-162, ST-11439, ST-136 i ST-1136. Pozostałe ST wystąpiły pojedynczo. Wśród badanych izolatów N. meningitidis w latach 2015-2016 znaleziono przedstawicieli 15 kompleksów klonalnych (cc), do których należały 62 izolaty. Najwięcej izolatów należało do kompleksów 41/44cc (n=8), 53cc (n=4), 162cc (n=3), 60cc i 254cc (n=2). W modelach regresji logistycznej jednoczynnikowej i wieloczynnikowej określono trzy istotne statystycznie czynniki ryzyka wystąpienia nosicielstwa: wiek, palenie papierosów i stopień wojskowy. Młodszy wiek, nikotynizm oraz posiadanie niższego stopnia wojskowego powodowało zwiększenie prawdopodobieństwa nosicielstwa Neisseria meningitidis. Przeprowadzone badania i analizy pozwoliły na wysunięcie następujących wniosków: poziom nosicielstwa Neisseria meningitidis wśród badanych żołnierzy zawodowych w latach 2015-2016 wynosiło dpowiednio 4,9%, 5,2% i 8,6%. Tym samym był porównywalny z wynikami szacowanymi w populacji ogólnej w Polsce; najczęściej izolowanymi szczepami były meningokoki grupy B (40,3%), E29 (11,7%), C (10,4%), Y (7,8%). Kompleksami klonalnymi charakterystycznymi dla szczepów wywołujących inwazyjną chorobę meningokokową w populacji polskiej, które wystąpiły u 15,8% nosicieli w środowisku wojskowym, były ST-213cc, ST-32cc, ST-41/44cc, ST-103cc, ST-167cc, ST-92cc, ST-22cc; czynnikami socjodemograficznymi wpływającymi na wzrost ryzyka występowania nosicielstwa Neisseria meningitidis wśród żołnierzy zawodowych są, podobnie jak w środowisku rekrutów wojskowych, młody wiek, niski stopień wojskowy i palenie papierosów; obowiązkowe szczepienia przeciw zakażeniom Neisseria meningitidis w wojsku powinny być w pierwszej kolejności wykonywane u żołnierzy pełniących służbę w ciężkich warunkach środowiskowych. Wprowadzenie immunoprofilaktyki dla całego stanu osobowego Sił Zbrojnych RP powinno być poprzedzone badaniami przesiewowymi określającymi aktualną sytuację epidemiologiczną i charakterystykę mikrobiologiczną zakażeń meningokokowych w środowisku wojskowym.