Ekspresja receptorów dla hormonów steroidowych naskórkowego czynnika wzrostu typu 2 oraz czynnika wzrostu tkanki łącznej w raku pęcherzyka żółciowego i tkance zdrowej

Abstract

Rak pęcherzyka żółciowego (RPŻ) jest złośliwym nowotworem, który wywodzi się z komórek nabłonka błony śluzowej pęcherzyka żółciowego. RPŻ stanowi 80-95% raków dróg żółciowych, charakteryzuje się niekorzystnym rokowaniem i wysoką śmiertelnością.Odsetek 5-letnich przeżyć u chorych z rozpoznaniem RPŻ w Polsce nie przekracza 10%. W przypadku chorych na nieresekcyjnego lub nawrotowego RPŻ jedyną skuteczną metodą, która wpływa na poprawę parametrów przeżycia jest chemioterapia z udziałem gemcytabiny i cisplatyny. Dlatego też u chorych na RPŻ tak ważne jest opracowanie nowych metod leczenia systemowego co wiąże się z poznawaniem patomechanizmów molekularnych związanych z etiopatogenezą tego nowotworu. W niniejszej pracy przeprowadzono ocenę porównawczą ekspresji receptorów dla hormonów steroidowych (estrogenowego i progesteronowego), czynnika wzrostu tkanki łącznej (CTGF, ang. Connective Tissue Growth Factor) oraz drugiego receptora naskórkowego czynnika wzrostu (HER2, ang. Human Epidermal Growth) w raku pęcherzyka żółciowego (RPŻ) i tkance zdrowej oraz ich wartości prognostycznej. Przedstawiony w pracy materiał obejmuje grupę 60 chorych na RPŻ (w tym 51 kobiet i 9 mężczyzn) rasy kaukaskiej, leczonych w latach 2004-2016 w czterech ośrodkach onkologicznych w Polsce: Wojskowym Instytucie Medycznym w Warszawie, Klinice Onkologii i Radioterapii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego w Gdańsku, Opolskim Centrum Onkologii im. prof. Tadeusza Koszarowskiego w Opolu oraz Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym im. J. Korczaka w Słupsku. Analizę danych klinicznych przeprowadzono na podstawie: danych z dokumentacji medycznej, informacji z Biur Ewidencji Ludności dotyczących ewentualnej daty zgonu, informacji z innych ośrodków onkologicznych, informacji uzyskanych od chorych i ich rodzin. Komputerową, zanonimizowaną bazę zawierającą dane kliniczne zamknięto 1 marca 2018 roku. Ocenę ekspresji ERβ, ERβ, PgR, HER2 i CTGF (immunohistochemiczne, IHC) wykonano w oparciu o dostępny, archiwalny materiał tkankowy, z radykalnych lub paliatywnych zabiegów u chorych na RPŻ, z wykorzystaniem przeciwciał, kolejno: DAKO; anti-human; królicze klon EP1; Abcam; anti-human; królicze klon EPR3778; ab133467; DAKO; anti-human; mysie klon 636; Ventana; królicze klon 4B5; Santa Cruz, California; kozie sc-14939. W przypadku niejednoznacznego wyniku HER2 (IHC) ocenę liczby kopii genu HER2wykonano metodą FISH (ang. fluorescent in situ hybridization). Wycinki guzów wybarwionych hematoksyliną i eozyną poddane zostały ponownej ocenie histopatologicznej. Bioptaty fragmentów RPŻ i otaczającej tkanki zdrowej -„rdzenie tkankowe” (ang. tissue core) umieszczano we wcześniej przygotowanych, beztkankowych blokach parafinowych –„biorcach”. Mikromacierze tkankowe wykonywano za pomocą aparatu Manual tissue arrayer I firmy Beecher Instruments (MTAI, K7 BioSystems). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą środowiska statystycznego R w wersji 3.4.3. Mediana obserwacji wyniosła 242 dni (zakres 0 do 5075 dni). Mediana czasu całkowitego przeżycia 415 dni (zakres od 1 do 5075 dni). Średnia wieku chorych w momencie rozpoznania 67 lat (zakres 31-97 lat), mediana BMI 26,2 (mediana 17,7-45,3), 49 chorych (82%) zostało poddanych leczeniu operacyjnemu (cholecystektomia z/lub bez limfadenektomii wrotnej i hepatektomii, u 35 (58%) chorych stwierdzono współistnienie kamicy żółciowej. Nawroty choroby stwierdzono u 31 chorych (52%), z czego 29 chorych (48%) zostało poddanych chemioterapii paliatywnej. We wszystkich przypadkach stwierdzono raka gruczołowego ang. Adenocarcinoma, NOS.Cechę pT1, pT2, pT3, pT4 stwierdzono kolejno u 13 (21,7%), 23 (38,3%), 14 (23,3%), 4 (6,7%) chorych, a u 6 (10,0%) nie określono cechy pT.Cechę pN0 i pN1 stwierdzono kolejno u 11 (18,3%) i 13 (21,7% chorych), u 36 chorych (60%) nie określono cechy p N (pNx). W 11 przypadkach (18,3%) obserwowano wysoko zróżnicowane raki (G1), w 29 przypadkach (48,3%) pośrednie zróżnicowanie (G2), natomiast nisko zróżnicowane RPŻ (G3) obserwowano u 11 chorych (18,3%). W wyniku przeprowadzonych analiz IHC, nie wykazano ekspresji ERβ w RPŻ i tkance zdrowej. W RPŻ w porównaniu z tkanką zdrową stwierdzono nieco wyższą ekspresję ERβ (p=0,0041) i niższą ekspresję HER2 oraz cytoplazmatyczną PgR (cytoPgR) (kolejno p=0,0002 i p<10-15). Nie stwierdzono różnicy w ekspresji CTGF pomiędzy RPŻ a tkanką zdrową (p=0,1634). Stwierdzono pozytywną korelację pomiędzy ekspresją HER2 i CTGF, w RPŻ i tkance zdrowej (p=0,003 i p=0,000). W RPŻ i tkance zdrowej wykazano pozytywną korelację ERβ i HER2 (nieznamienną statystycznie, kolejno p=0,056 i p=0,052). Ocena ekspresji ER, cytoPgR, HER2, CTGF w RPŻ nie wykazała związku z obecnością kamicy, kolejno p=0,39; p=1; p=1; p=0,17; p=1. Natomiast zaobserwowano wzrost ekspresji cytoPgR w tkance zdrowej u chorych z kamicą p=0,04. W badaniu IHC HER2(3+) stwierdzono w RPŻ u 3 chorych, IHC HER2(2+) w RPŻ w 9 przypadkach i 11 przypadkach w tkance zdrowej. W badaniu FISH amplifikację HER2 stwierdzono w 2 przypadkach RPŻ. Łącznie kryteria przyjęte dla HER2-dodatniego raka piersi stwierdzono u 5 chorych (8,2%). W analizie jednoczynnikowej stwierdzono związek pomiędzy skróceniem całkowitego czasu przeżycia a wiekiem >70 r.ż. (p=0,028) i cechą pT (p=0,031). Poprawę OS obserwowano w grupie chorych, którzy otrzymali chemioterapię w okresie uogólnienia choroby (p=0,002). Dla badanych biomarkerów (jako zmiennej ciągłej, bezprogowej H-score) stwierdzono korzystny związek pomiędzy OS a ekspresją ERβ w tkance zdrowej (p=0,025), z kolei ekspresja ERβ w RPŻ wiązał się z pogorszeniem OS (p=0,018). Cecha HER2 w RPŻ nie wpłynęła na OS (p=0,12). W analizie wieloczynnikowej związek z OS stwierdzono dla wieku > 70 r.ż. i cechy pT oraz ekspresji ERβ w RPŻ (p=0,003) lub w otaczającej tkance zdrowej (p=0,007). Wyniki przedstawione w pracy stanowią pierwszą łączną analizę ekspresji receptorów dla hormonów steroidowych -ERβ, β oraz PgR, HER2 i CTGF-zarówno w RPŻ i przylegającej tkance zdrowej w populacji polskiej, rasy kaukaskiej. W badanej grupie nie wykazano ekspresji ERβ w tkance RPŻ, jak i otaczającej tkance zdrowej, natomiast w RPŻ obserwowano wyższą ekspresję ERβ RPŻ w porównaniu do tkanki zdrowej. Co więcej ekspresja ERβ w RPŻ wiązała się z gorszym OS, a w tkance zdrowej pęcherzyka żółciowego z poprawą OS. Przeciwnie do ekspresji ERβ wyższą ekspresję cytoPgR stwierdzono w tkance zdrowej pęcherzyka żółciowego w porównaniu do RPŻ. Ponadto ekspresja cytoPgR w tkance zdrowej związana była z obecnością kamicy, co może wynikać z aktywacji genów zależnych od progesteronu, a jednocześnie negatywnie korelowała z ekspresją CTGF. W związku z uzyskanymi wynikami rola hormonów płciowych i ekspresji różnych izoform receptorów oraz szlaków metabolicznych w etiopatogenezie RPŻ wymaga dalszych badań. W niniejszej pracy wykazano, że w populacji kaukaskiej u chorych na RPŻ nadekspresja lub/i amplifikacja HER2 występuje rzadko w guzie pierwotnym (8% chorych) i nie jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. Nie stwierdza się różnicy w ekspresji CTGF w RPŻ i otaczającej tkance zdrowej oraz wpływu tego biomarkera na rokowanie. Odmienne wyniki odnośnie CTGF uzyskane w niniejszej pracy mogą wynikać z różnic w etiopatogenezie RPŻ pomiędzy populacja michilijską i kaukaską. Natomiast wykazano związek pomiędzy ekspresją HER2 i CTGF oraz ERβ w RPŻ i przylegającej tkance zdrowej co wskazuje na powiązanie tych szlaków sygnałowych w procesach fizjologicznych i patologii pęcherzyka żółciowego. Podobnie jak w wielu innych doniesieniach, w badanej grupie wiek chorych powyżej 70 r.ż. w momencie rozpoznania, i cecha pT wiązały się ze skróceniem OS. Oba czynniki w skojarzeniu z ekspresją ERβ w RPŻ lub otaczającej tkance zdrowej stanowiły najbardziej wartościowy model rokowniczy. Z uwagi na retrospektywny charakter pracy i względnie małą grupę chorych uzyskane wyniki należy interpretować z dużą ostrożnością, niemniej jednak stwarzają one przesłanki do dalszych badań. Aplikacyjna wartość uzyskanych wyników w aspekcie m.in. działań profilaktycznych, wymagałaby przeprowadzenia prospektywnych badań z losowym doborem chorych.